НАУЧНАЯ ОСНОВА ТЕХНОЛОГИИ

Биферментная система светящихся бактерий NAD(Р)H:FMN-оксидоредуктаза–люцифераза применяется в качестве индикатора на токсичность при мониторинге загрязнений окружающей среды, контроле качества продуктов питания (овощи-фрукты), контроле загрязнений питьевой воды и уровня загрязнений водоемов, контроле загрязнений воздуха, а также для определении наличия психологического и физического стресса человека и животных, контроля физической нагрузки спортсменов и др. Результатом реакции является биолюминесцентное свечение, которое фиксируется прибором-люминометр.

Биолюминесцентный метод анализа является относительным, т.е. уровень свечения реагента в пробе сравнивается с уровнем свечения в контроле (дистиллированная вода). Низкий уровень свечения реагента в пробе в сравнении с контролем говорит о наличие токсикантов, которые тушат свечение. Как и другие методы биотестирования, биолюминесцентный метод анализа является интегральным, так в отличие от химического анализа, определяющего концентрацию конкретного вещества, биолюминесцентный метод показывает общее (интегральное) наличие токсикантов, т.е. предупреждает об опасности для всего живого.

Результатом анализа является относительный «Индекс токсичности», он отражает интегральную концентрацию загрязнений. Схема анализа приведена ниже:

Для широкого использования биолюминесцентного метода анализа необходимо исключить сложности, связанные с применением "живых систем", которые требуют особых условий хранение лиофилизованных реагентов, подготовки реагентов, имеют высокую погрешность, необходимо высокая квалификация персонала. Решением является использование вместо "живых систем" только необходимые для реакции иммобилизованные ферменты и субстраты.

Иммобилизация ферментов, предложенная уже более 100 лет назад, позволяет обеспечить стабильность активности ферментов, возможность длительного хранения, простоту применения при проведении анализов. «Иммобилизация фермента» - это включение фермента в такую среду, которая позволяет ему обмениваться с внешней средой молекулами субстрата, эффектора или ингибитора.

Иммобилизация ферментов в гели позволяет сохранять его активность во времени и упростить процедуру применения, т.к. полученный при иммобилизации реагент включает необходимые для реакции ферменты и субстраты, которые фиксируются в 3-х мерной сетке гелеобразующего вещества из тесно переплетенных полимерных цепей, при этом расстояния между нитями сетки меньше размеров молекул, поэтому они «зажаты».

Наиболее оптимальным гелеобразующим веществом для иммобилизации в гели бактериальной биферментной системы NAD(Р)H:FMN-оксидоредуктаза–люцифераза, признан нейтральный крахмальный гель. Иммобилизация в крахмальный гель показала наиболее высокую активность и время хранения реагента, иммобилизованный ферментативный реагент представляет собой плоский сухой диск диаметром 3-5мм. Схематично процесс иммобилизации и реагент представлены ниже:

Реагент в такой форме во многом решает вопросы сохранения активности, снижает погрешность и упрощает процедуру, но и такой реагент имеет недостаток – необходимы квалификация и опыт персонала. При проведении анализа требуется аккуратность внесения реагента в измерительную кювету (она может деформироваться, диск реагента может оказаться на стенке, на дне кюветы или всплыть), а это значит есть проблема человеческого фактора – все это приводит к искажению результатов.

Решение есть - применение иммобилизации реагента в одноразовые измерительные кюветы, которые минимизируют человеческий фактор и позволят обычному потребителю использовать технологию для своих целей. Схематично процесс иммобилизации представлен ниже: